基于SLAF-seq技术鉴定苹果砧木耐涝候选基因

【背景】苹果（Malus×domestica Borkh）是我国主要栽培果树树种之一,但部分苹果产区由于夏、秋季的大量集中降雨和排水不良等造成果园涝害频繁发生,导致苹果树叶片黄化、脱落,果实品质和产量下降。【目的】鉴定苹果耐涝相关基因,为苹果耐涝分子标记辅助育种和优质高产栽培提供依据。【方法】以耐涝苹果砧木G41和不耐涝苹果砧木新疆野苹果（M. sieverii (Ledeb) Roem.）及其构建的包含495个F₁杂交后代为材料,从F₁杂交群体中挑选出耐涝和不耐涝株系各50株,构建两个极端性状DNA混池,采用简化基因组测序（SLAF-seq）技术,开发SLAF标签和SNP标记,结合苹果基因组信息和遗传关联性分析,对苹果耐涝基因进行定位及候选基因预测,并对候选基因在耐涝差异的株系中进行淹水胁迫下的表达分析。【结果】以‘金冠’苹果为参考基因组,共开发119 072个SLAF标签,其中多态性SLAF有11 133个。通过序列分析和检测SNP位点,共获得6 237 071个SNP,其中高质量SNP有170 617个。通过ED和SNP-index方法关联分析,获得一个与耐涝性状紧密关联的候选区域,位于苹果第10号染色体1.94—3.25 Mb,关联区域大小为1.31 Mb,关联区域内包含120个基因。对该区域内基因进行功能注释,发现一个与呼吸代谢相关的基因—乙醇脱氢酶基因ADH1（MD10G1014500）,在淹水处理后1、2、4和6 d,该基因在耐涝植株中的表达量显著高于不耐涝植株。【结论】将苹果耐涝基因定位于第10号染色体1.94—3.25 Mb处,筛选到可能与苹果耐涝相关的候选基因MD10G1014500,可用于苹果耐涝基因的克隆和功能解析。     

甘草总黄酮对高脂条件下罗非鱼肝损伤的保护作用

为了研究甘草总黄酮对高脂饲料造成的罗非鱼(Oreochromis niloticus)脂肪肝损伤是否具有保护作用,随机将180尾健康无伤罗非鱼分成6组,即对照组、高脂饲料模型组和4个不同浓度甘草总黄酮组(0.05、0.10、0.50、1.00 g·kg^-1甘草总黄酮),每组30尾。饲喂90 d后,采集罗非鱼各实验组肝,测定肝匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)活性、丙二醛(MDA)含量、甘油三酯(TG)含量、总胆固醇(TC)含量、总抗氧化能力(T-AOC)水平,Western blotting法检测肝中核转录因子-κB P65(NF-κB P65)和核转录因子-κB C-Rel (NF-κB C-Rel)蛋白表达水平,RT-PCR法测定肝中微粒体甘油三酸酯转移蛋白(MTTP)和载脂蛋白B100(ApoB100)基因表达情况。结果表明:与对照组相比,高脂饲料模型组罗非鱼肝匀浆中TG、TC、MDA含量极显著(P<0.01)升高,GSH活性、SOD活性、T-AOC水平均极显著(P<0.01)降低;MTTP和ApoB100 mRNA表达水平降低(P<0.01或P<0.05);Western blotting结果显示,NF-κB P 65和C-Rel蛋白表达水平升高。饲料中加入甘草总黄酮后,与高脂饲料模型组相比,罗非鱼肝中GSH活性、SOD活性、T-AOC水平不同程度提高,TC、TG、MDA含量和NF-κB P65、C-Rel蛋白表达水平不同程度降低,MTTP和ApoB100的mRNA表达水平升高,以0.50 g·kg^-1甘草总黄酮组效果较好。说明甘草总黄酮对于罗非鱼脂肪肝损伤具有一定的保护作用,可以缓解高脂饲料造成的脂肪肝损伤。     

牛星状病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

牛星状病毒(BAstV)是我国新发的犊牛腹泻病原,本试验的目的是建立检测BAstV的Real-time PCR方法。根据BAstV流行株的ORF1a基因序列设计引物,通过优化反应条件和体系,成功建立基于EvaGreen检测BAstV的Real-time PCR方法。结果表明,该检测方法的Ct值与标准品模板在1.36×10¹~1.36×10⁸拷贝/μL线性关系良好,相关系数R²=0.999,扩增效率为93.79%;该方法可特异性检出BAstV,对犊牛腹泻其他相关病原呈阴性;最低检测下限为13.6拷贝/μL;批间和批内的变异系数均小于2%,重复性好。对2017年9月至2019年5月采自河南省的221份犊牛腹泻样本进行检测,BAstV的检出率为18.1%(40/221),采样场阳性率为100.0%(14/14)。本试验所建方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,为BAstV的检测和流行病学调查提供了有力手段。     

3株鸽源新城疫病毒的分子特征及对鸽的致病性

2011―2013年在新城疫流行病学调查中分离到3株鸽源新城疫病毒(SDS,SD01和SD02),为了进一步了解其生物学特性和遗传进化规律,对3株病毒进行了测序和生物活性分析,并对分离株SDS对鸽的致病性进行了评价。结果表明,毒株SDS基因组全长为15192 bp,基因排列方式为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′,3个分离株F蛋白裂解位点氨基酸序列均为¹¹²RRQKRF¹¹⁷,具有典型的新城疫强毒的分子特征。系统进化分析表明这3个毒株与基因Ⅵ型NDV毒株聚于一簇,属于ClassⅡ系Ⅵb基因型。3个分离株F蛋白的融合肽和七肽重复区,HN蛋白的抗原中和表位存在多处突变,与单克隆抗体1E5、2F10的反应性也发生改变,表明3个分离株与疫苗株LaSota有明显的抗原差异。SDS攻毒试验结果显示,试验鸽自攻毒后5 d出现明显的临床症状,滴鼻组和肌肉注射组的死亡率分别为60%和70%;病死鸽剖检可见脑膜充血出血,腺胃乳头、腺胃肌胃交界及肠道出血,肝脏肿大,脾有淤血斑。滴鼻组在攻毒后5~14 d于喉头和泄殖腔检出排毒,而肌肉注射组在攻毒后3~14 d于喉头和泄殖腔有排毒。     

辣椒几丁质酶类基因家族的全基因组鉴定和表达特征分析

几丁质酶（chitinase, EC 3.2.1.14）是一种降解几丁质的糖苷酶,在植物应对非生物和生物胁迫中起重要作用。本研究对辣椒几丁质酶类（Capsicum annuum chitinase-like, CaCTL）基因家族成员进行了全基因组注释、进化分析和基因表达模式分析。从最新的辣椒基因组数据库中鉴定出31个CaCTL成员。根据系统发育进化树将这些成员分为GH18和GH19亚家族,并进一步分为5个亚类（Ⅰ~Ⅴ类）。保守基序分析结果表明,每个亚类中的成员存在功能相关性。对辣椒、矮牵牛以及番茄的CTL基因家族成员同源性分析表明,在矮牵牛和番茄中分别有7个和11个辣椒CaCTL的同源基因。通过qRT-PCR分析发现,在正常环境生长的辣椒植株中,64.2%的GH18亚家族的CaCTL成员表达水平很低,有64.7%的GH19亚家族成员在不同组织中存在差异表达。顺式作用元件分析表明,CaCTL成员启动子区域存在许多激素反应以及生物和非生物应激相关元件。当植物遭受不同的非生物胁迫时,qRT-PCR结果显示,多数CaCTL成员表达上调。当植物遭受高温干旱条件时,多个CaCTL成员的表达上调明显。上述结果丰富了CTL基因家族进化的研究,为探索CaCTL成员的功能提供了数据基础。     

Transport of cadmium from soil to grain in cereal crops: A review

Due to rapid urbanization and industrialization, many soils for crop production are contaminated by cadmium(Cd), a heavy metal highly toxic to many organisms. Cereal crops such as rice, wheat, maize, and barley are the primary dietary source of Cd for humans, and reducing Cd transfer from soil to their grains is therefore an important issue for food safety. During the last decade, great progress has been made in elucidating the molecular mechanisms of Cd transport, particularly in rice. Inter-and intraspecific variations in Cd accumulation have been observed in cereal crops. Transporters for Cd have been identified in rice and other cereal crops using genotypic differences in Cd accumulation and mutant approaches. These transporters belong to different transporter families and are involved in the uptake, vacuolar sequestration, root-to-shoot translocation, and distribution of Cd. Attempts have been made to reduce Cd accumulation in grains by manipulating these transporters through overexpression or knockout of the transporter genes, as well as through marker-assisted selection breeding based on genotypic differences in Cd accumulation in the grains. In this review, we describe recent progress on molecular mechanisms of Cd accumulation in cereal crops and compare different molecular strategies for minimizing Cd accumulation in grains.     

牛TLR4基因生物信息学分析

为了更加深入地了解牛TLR4基因的功能、结构及与该基因有关联的疾病识别及其致病机理,利用牛TLR4基因的氨基酸序列对其编码蛋白的基本理化性质、蛋白质译后的磷酸化位点和糖基化位点以及跨膜结构域和蛋白质结构进行预测。结果显示,牛TLR4基因一共编码841个氨基酸,负电荷残基总和(Asp+Glu)为84,正电荷残基总和(Arg+Lys)为76,不稳定指数小于40,表明该基因编码产物稳定性较好。在该基因整个编码产物中,亲水氨基酸占比较多,平均分值为-0.011,由此得知TLR4基因编码的蛋白质是一种易溶蛋白。有9个潜在的N-糖基化位点;78个磷酸化位点以及存在一个跨膜蛋白和存在信号肽,其切割位点在第25和第26个氨基酸之间。蛋白质的二、三级结构预测结果显示,二级结构和三级结构均由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成,其在生物合成、基因表达与调控等方面有重要作用。本研究结果可为牛TLR4基因深入研究提供理论基础。     

Aux/IAA基因家族鉴定及对大豆茎尖发育的调控作用分析

Aux/IAA 基因家族在植物茎尖发育过程发挥重要作用。为了探究大豆Aux/IAA 基因家族在大豆茎尖发育过程的调控作用，本文以拟南芥Aux/IAA 基因家族蛋白序列为参照鉴定了大豆全基因组Aux/IAA 家族基因，包括63个成员；然后以拟南芥、鹰嘴豆和大豆的Aux/IAA 家族为研究对象，比对这些基因全长氨基酸序列并构建进化树，结果表明三种作物的Aux/IAA 家族成员间亲缘关系差异明显，进化过程中同源重组频率不同；进而利用RNA-seq技术分析东农594（DN）、Charleston（CH）及二者杂交后代的RIL群体的高矮秆池（WH、WS）和F2群体的高矮秆池（JH、JS）的差异表达基因及其功能，共有17个Aux/IAA 基因在3组材料中差异表达。CHvsDN组有15个差异表达基因，JHvsJS组有2个，WHvsWS组只有1个；其中，Glyma.10G180100 在JHvsJS组和WHvsWS组均差异表达，这些结果为进一步研究大豆Aux/IAA 基因家族的功能及调控茎尖发育提供理论依据。     

甜菜BvGSTU9基因的生物信息学及在镉胁迫下的表达分析

为了进一步研究甜菜谷胱甘肽转移酶BvGSTU9 (LOC104894060)在重金属胁迫过程中的功能。本研究以‘780016B/12优’为实验材料,对该基因序列特征、结构、功能进行预测分析,并利用qPCR检测该基因在不同浓度镉胁迫下的表达量变化。结果显示甜菜BvGSTU9基因全长925 bp,开放阅读框675 bp,编码了由224个氨基酸组成的不稳定膜外蛋白。BvGSTU9与菠菜、藜麦的氨基酸序列相似性较高,与系统发育进化树分析结果基本相符。二级和三级结构预测表明该基因主要由α-螺旋、β-折叠、延伸链及无规则卷曲组成。qPCR显示BvGSTU9基因在不同浓度的镉胁迫下均受到不同程度的诱导,因此可以推断甜菜BvGSTU9基因无论从结构还是功能上,与镉逆境胁迫存在着一定的应答关系。研究结果也为甜菜耐重金属镉机制研究提供参考依据。     

SSCP Marker Development and Analysis of Candidate Restorer Gene Rf1 for Cotton Cytoplasmic Male Sterility

[Objective] Locating the cotton cytoplasmic male sterility (CMS) restorer gene Rf₁ is important for investigating restorer gene mechanisms and improving restorer lines. In our previous study, a gene cluster, with nine Pentatricopeptide repeat(PPR) genes and nine other genes, was found within the 160-kb Rf₁ target region in Scaffold 333. The objective here was to improve the density of Rf1-linked markers in the target region and determine the expression profiles of candidate genes. [Method] Using the sequences of the 18 genes, we designed 155 single-strand conformation polymorphism (SSCP) primers covering all of the gene sequences to identify the polymorphic SSCP markers between the fertile and sterile pools. Additionally, real-time polymerase chain reaction(PCR) was performed to analyze the expression profiles of eight candidate genes in the four developmental stages of buds of sterile, maintainer and restoring lines, respectively. [Result] In total, 15 polymorphic primers were identified. A genotype analysis of the F₂ population was conducted using the 15 primers and 3 other polymorphic simple sequence repeats (SSR) markers. The markers were distributed in a 4.8 cM range. In addition, owing to the influence of sterile cytoplasm or restorer genes, most of the genes showed different expression patterns in the four developmental stages of the three lines' buds. [Conclusion] SSCP markers tightly linked to Rf₁ were identified and the expression profiles of candidate genes were determined. This study provides a basis for the further fine mapping of restorer genes and for candidate gene screening.